Česká technologická platforma pro zemědělství (ČTPZ)

Klíčová slova: "diagnostika, protozoární paraziti"

---

 

Parazitologie je vědní obor zabývající se druhy parazitů, jejich vývojovými cykly, hostiteli a vztahy mezi nimi. Veterinární parazitologii lze systematicky rozlišit na endoparazity, parazitující uvnitř živých organismů a ektoparazity, kteří parazitují vně. Mezi endoparazity řadíme: protozoa (prvoky) a helminty (červi). K ektoparazitům náleží různé druhy členovců (např. vši klíšťata, blechy, komáři aj.). Literární rešerše se dále zabývá pouze prvoky u přežvýkavců. Prvoci jsou jednobuněčné eukaryotické organismy nabývající velikosti v rozsahu 10 – 150 µm. Za jejich mikroskopický průkaz v krvi byla dokonce v roce 1907 udělena Nobelova cena. Tuto skupinu parazitů lze rozdělit na parazity s monoxenním vývojovým cyklem, v jejichž životním cyklu figuruje pouze jeden hostitel, (například Tritrichomonas, Eimerie, Cryptosporidium) a druhy s heteroxenním vývojovým cyklem. Tito potřebují ke zdárnému přežití parazita jak definitivního hostitele, ve kterém se pohlavně množí, tak také mezihostitele (například Sarcocystis, Toxoplasma, Neospora, Hammondia, Besnoitia, Babesia). Dalším možným dělením skupiny protozárních parazitů je z hlediska jejich lokalizace v hostiteli. Můžeme je takto rozdělit na pohlavní, střevní, tkáňové a krevní parazity. Neposledním, z hlediska terénní praxe vhodnějším dělením, je rozlišování parazitů na základě druhové specifity. Systematické dělení a taxonomie u prvoků prodělává neustálé změny, a jak bylo uvedeno, existuje několik klasifikačních schémat.

Seznam protozoárních parazitů, kteří se vyskytují u přežvýkavců v ČR je následující: Tritrichomonas foetus, Giardia intestinalis, Eimerie spp. (pro skot patogenní hlavně E. zuernii, E. bovis, vysoce patogenní zástupci E. ovina, E. ovinoidalis u ovcí a E. arlongi, E. christensi a E. ninakohlyakimovae u koz) , Cryptosporidium parvum, Sarcocystis spp. (hostitelsky specifické, z těch více patogenních to jsou např. u skotu: S. cruzi, hirsuta, hominis, u ovcí: S. tenella, medusiformis, u koz S. capracanis), Toxoplasma gondii, Neospora caninum, Hammondia heydorni, Besnoitia besnoiti. Seznam uvedených parazitů je samozřejmě možný dále rozšiřovat. Toto rozšiřování jde ruku v ruce se zvyšujícím se cestovním ruchem, migrací hostitelských organismů, importem zvířat z dříve ne dobře dostupných lokalit a podobně. Jako příklad lze uvést rod Babesia z řádu krvinkovek, což jsou paraziti původně tropů a subtropů, které však jsou již běžně rozšířeni i v našem klimatickém pásu u psů (u skotu se tedy dá předpokládat, že se může vyskytovat).

V následujících odstavcích jsou uvedeny stručné charakteristiky jednotlivých parazitárních agens, či případně uvedeny zajímavosti z pohledu diagnostiky těchto patogenů:

 

Tritrichomonas foetus

Trichomoniáza je onemocnění způsobené bičíkatým prvokem Tritrichomonas foetus. Jedná se o onemocnění pouze pohlavních orgánů dobytka. Krávy se nakazí po spáření s infikovaným býkem a onemocnění rozvíjející se v jejich pohlavním aparátu může vést k potratu plodu. Jak už bylo řečeno, plemenný býk hraje roli mechanického přenašeče nákazy. Bičíkovec přežívá na povrchu a v kryptách sliznice penisu. Čím starší býk je, tím více se prohlubují krypty sliznice penisu a býk se stává chronicky infikovaným. Proti tomuto onemocnění neexistuje léčba a chronicky infikované zvíře je odsouzeno k vyřazení.

Mezi kontrolní opatření proti trichomoniáze patří vyšetření všech plemenných býků na konci připouštěcí sezóny a následné vyřazení pozitivních jedinců, vyšetření nově zařazujících býků do plemenitby, nezařazování zvířat ze stáda s neznámou nákazovou situací [1]. Navzdory zvýšené informovanosti a osvědčeným kontrolním strategiím představuje trichomoniáza stále velký zdroj ekonomických ztrát v jižní Africe, v Severní, Střední i Jižní Americe, Austrálii a Asii [2]. V České republice na základě vydané Metodiky pro kontrolu zdraví a nákaz zvířat, je povinností každého chovatele nechat vyšetřit plemenné býky určené pro přirozenou plemenitbu v období 28 dnů před přemístěním (zařazením) do přirozené plemenitby, plemenné býky v období karantény (před přesunem do provozní ISB) a plemenné býky v inseminačních stanicích 1x ročně – v souladu s přílohou č. 2 k vyhlášce č. 380/2003 Sb. Vhodnými vzorky pro mikroskopické a kultivační vyšetření jsou výplašky a seškraby z prepuciálního vaku, výplachy a stěry z dělohy/vaginy. Tyto jsou možné zaslat také pro molekulární vyšetření PCR, společně s placentou či zmetaným plodem. Vyšetření vzorků molekulární metodou PCR má výhodu v rychlosti analýzy vzorků (během 1 dne), oproti kultivaci, kde k potvrzení pozitivního výsledku je nutné často čekat i 6 dní [2].

 

Giardia intestinalis - Giardie se nacházejí v tenkém střevě hostitele ve formě vegetativních bičíkatých stádií, která mají typickou morfologii. Giardie nepronikají do buněk a parazitují pouze na povrchu střevní sliznice. V tenkém střevě se intenzivně množí a narušují vstřebávání živin (zejména tuky a vitamíny rozpustné v tucích) ve střevě. Výsledkem je průjmové onemocnění zvané giardóza, řadící se mezi typické oportunní infekce. K infekci hostitelů Giardiemi dochází prostřednictvím tenkostěnných cyst, které jsou vylučovány do vnějšího prostředí stolicí člověka nebo trusem zvířat. Cysty dlouhodobě přežívají v prostředí, především ve vodě (pitná, jezerní, říční, mořská), kde mohou cysty zůstat infekční při teplotě do 4° C po dobu několika měsíců. Standardní intravitální diagnostika giardiózy je založena na mikroskopickém průkazu cyst v trusu zvířat. Vylučování cyst v průběhu střevní infekce je nepravidelné a pro správnou diagnostiku je třeba vyšetřit trus opakovaně v rozmezí několika dní. Základním vyšetřením je jednoduchý roztěr klinického materiálu a mikroskopické vyšetření roztěrů na přítomnost cyst Giardií. Při vyšetření roztěrů lze využít také různé barvicí techniky na zvýraznění cyst. Pro zvýšení citlivosti vyšetření trusu se také používají různé koncentrační metody, včetně klasické flotační koprologické metody. V současné době se často používají komerční soupravy založené na vazbě značených specifických protilátek s povrchovými antigeny cyst Giardií. Tyto testy pak využívají různé způsoby vizualizace komplexů navázaných protilátek na povrchové antigeny cyst (imunofluorescence, ELISA, imunochromatografické testy). V diagnostice giardiózy se stále více také uplatňují molekulárně genetické metody na bázi polymerázové řetězové reakce, tzv. PCR.

 

Eimeria sp. - V současné době je popsáno již okolo 1200 druhů těchto kokcidií. Životní cyklus zahrnuje střídání exogenní fázi zrání oocyst a endogenní fázi v rámci hostitele, kde se střídá sexuální a asexuální množení. Eimerie napadají a ničí střevní buňky hostitele, což vede k anémii, ztrátě elektrolytů a špatné absorpci živin. Nejběžnějším klinickým příznakem infekce je průjem a postižené ovce a kozy mohou vykazovat nízký přírůstek hmotnosti a celkovou slabost. Dříve byla morfologie sporulovaných oocyst používána k identifikaci různých druhů Eimerií, ale s vývojem molekulárních metod se na tyto metody přešlo k přesné druhové klasifikaci, zejména tam, kde je morfologická diferenciace obtížná kvůli podobnosti tvaru a velikosti [3]. Protože životní cyklus Eimeria sp. zahrnuje několik fází včetně intracelulárního, extracelulárního, asexuálního a sexuálního, je diagnostika pomocí sérologických metod značně obtížná. Kokcidie skotu, ovcí a koz jsou hostitelsky specifické a v raném období života jsou narození jedinci vystaveni infekci jedním či více kmeny kokcidií. Je důležité rozlišovat mezi infekcí kokcidiemi a klinickým onemocněním vyvolaným kokcidiemi samotnými - kokcidiózou. Pro telata do 6 měsíců věku mohou být patogenní kokcidie rodu Eimeria zuerni, E. bovis, E. aurburnesis. Za velmi patogenní pro kozy se považuje Eimeria ninakohlyakimovae, pro ovce E. ovinoidalis a E. crandallis.

 

Cryptosporidium parvum - Kryptosporidie jsou jednobuněční parazité, kteří svým vývojem a dalšími vlastnostmi připomínají kokcidie. Jejich vývoj ve formě nepohlavního množení a pohlavního množení probíhá na povrchu slizničních buněk a výsledkem tohoto vývoje jsou tzv. oocysty, které jsou vylučovány do vnějšího prostředí a jsou zdrojem infekce pro nového hostitele. Oocysty kryptosporidií jsou odolné, dlouhodobě přežívají ve vnějším prostředí. Přenášejí se přímým kontaktem s infikovaným hostitelem fekálně-orální cestou nebo pozřením oocystami kontaminovaného krmiva/potravin či vody.

Hlavním zdrojem vylučování oocyst Cryptosporidium parvum jsou mláďata do 4. týdnů věku, u kterých rozvinutí klinických příznaků závisí na síle infekce, imunitním stavu jedince a dalších přidružených patogenních původců. Vzhledem k velkému počtu vylučovaných oocyst kryptosporidií v trusu pozitivních jedinců je možné detekovat oocysty mikroskopicky přímo v roztěrech trusu. Další možností detekce oocyst kryptosporidií v roztěrech trusu jsou imunofluorescenční metody využívající specifických protilátek proti povrchovým antigenům oocyst a vizualizací za pomoci světelného fluorescenčního mikroskopu. Dalšími imunologickými metodami jsou různé modifikace enzymatických imunoanalýz ELISA s detekcí antigenů kryptosporidií. Imunologické metody detekce kryptosporidií jsou komerčně dostupné v různých modifikacích včetně imunochromatografických testů, avšak některé komerční soupravy protilátek nerozpoznávají všechny druhy nebo genotypy kryptosporidií. Molekulární metody na bázi PCR se používají stále častěji a nejčastěji jsou využívány k identifikaci kryptosporidií na úrovni druhu. Molekulární metody, které používají PCR a sekvenování PCR produktů, posouzení polymorfismu restrikčních fragmentů PCR, testy PCR v reálném čase nebo multiplexní PCR jsou citlivější než mikroskopické a imunologické testy.

Toxoplasma gondii (TG) také patří do skupiny kokcidií, podmíněně vícehostitelských. Zaujímá pozici nejrozšířenějšího zoonotického parazita na naší planetě. Existují tři infekční stadia TG: tachyzoiti (exkrety, krevní řečiště)y, v tkáňových cystách jako bradyzoity a v oocystách jako sporozoity. Biologický životní cyklus je rozdělen na pohlavní a nepohlavní fázi. Sexuální cyklus je omezen na kočičí střevo a vede k vylučování oocyst ve výkalech koček. Aktivované oocysty (vylučování kočkou) se stávají extrémně infekčními a mohou přežít v prostředí po dlouhou dobu (několik měsíců) a možná i roky. Mezihostitelem se může stát jakýkoli teplokrevný živočich, který se nakazí pozřením infekční oocysty. Ve vnějším prostředí a vodním ekosystému jsou oocysty velmi odolné a v závislosti na vnějších podmínkách zůstávají infekční měsíce až roky [4]. U skotu klinické případy infekce nebyly hlášeny, ale skutečný problém toxoplazmózy u skotu spočívá v tom, že tkáně infikovaných zvířat mohou obsahovat tkáňové cysty, kterými se může nakazit také člověk [5]. Diagnóza toxoplazmózy se provádí biologickými, sérologickými, histologickými nebo molekulárními metodami, nebo kombinací výše uvedených. Klinické příznaky toxoplazmózy jsou nespecifické a nejsou dostatečně charakteristické pro definitivní diagnózu. Navíc toxoplazmóza ve skutečnosti napodobuje několik dalších onemocnění [6]. Toxoplasmóza bývá často diskutována především u malých přežvýkavců jako příčina abortů, nicméně toto onemocnění jako příčina abortů i jako klinická toxoplazmóza je závažnější v chovech koz, než-li v chovech ovcí. Úspěchem obecně je, objasní-li se příčina všech abortů z 50% [7].

 

Sarcocystis spp. je další velmi početný rod kokcidií, s druhy hostitelsky specifickými, který vytváří tkáňové cysty, tzv. sarkocysty. Jedná se o obligátně heteroxenní parazity. Ke svému životu potřebují mezihostitele (skot, koza/ovce, prase, kůň; ve kterém probíhá nepohlavní část vývojového cyklu - tvorba sarkocyst ve tkáních) a definitivního hostitele (masožravci; v jejichž střevě probíhá pohlavní část vývojového cyklu s následným vylučováním infekčních sporocyst trusem do prostředí). Skot může být hostitelem 5 druhů Sarcocyst (S, cruzi, S. hirsuta, S. hominis, S.rommeli, a S. heydorni). Prevalence bovinní sarkocystózy celosvětově je velmi vysoká. Skot slouží hlavně jako mezihostitel, u kterého se sarkocstóza projevuje jako chronická infekce s postižením predilekčních tkání jako jsou srdce, jazyk, jícen a bránice [8]. Konvenční metoda pro identifikaci Sarcocyst ze vzorků tkáně je založena na průkazu tkáňových cyst za pomoci světelného či elektronového mikroskopu. Tyto metody jsou časově náročné, omezené pro použití u velkého množství vzorků a bohužel neumějí spolehlivě rozlišit jednotlivé druhy Sarcocyst. Metody molekulární analýzy (RAPD-PCR, RFLP-PCR) jsou dostupné a vhodné pro detekci a genotypizaci jednotlivých druhů tkáňových cyst [8].

 

Neospora caninum a Hammondia heydorni - Neospora caninum (NC) patří mezi obligátní intracelulární jednobuněčné paraziti kmene Apicomplexa. Od roku 1988 je NC známa jako samostatný druh, do té doby byla díky své morfologické podobnosti zaměňována s Toxoplasmou gondii (TG). Definitivním hostitelem jsou psovité šelmy (psi, kojoti, vlci) kterým onemocnění neosporózou způsobuje neuromuskulární onemocnění, které může vést i k smrti hostitele. Za hlavního mezihostitele NC je považován skot, ale zřídka onemocní i ovce a kozy. Jelikož je infekce NC úzce spojena se psy, jako oportunistickým hostitelem se může stát i člověk. Infekčním stádiem jsou oocysty, které vylučují definitivní hostitelé exkrementy do prostředí. Tyto jsou velmi odolné vůči vlivům vnějšího prostředí a jsou schopny v něm dlouze přežívat a nakazit mezihostitele, který je pozře s potravou. V těle mezihostitele se z oocyst uvolňují tachyzoiti, kteří se množí v buňkách a napadají různé tkáně, kde se zapouzdřují v cysty, tzv. bradyzoity. Hlavní cestou přenosu mezi hostiteli je transplacentární přenos (představuje 50-95% infekcí). Přestože NC byla detekována i v semeni býků, přenos touto cestou, stejně jako laktogenní cestou je nepravděpodobný [9, 10].

Neosporóza je považovaná za hlavní příčinu abortů u skotu jak dojného tak masného. Většina neosporózou způsobených abortů se vyskytuje v 5. a 6. měsíci březosti.. Telata mohou být mrtvě narozena nebo narozena s klinickými příznaky, narozena bez potíží, ale s chronickou infekcí. Klinické příznaky jsou hlášeny pouze u telat mladších dvou měsíců, u kterých se můžeme setkat s neurologickými příznaky (ataxie, snížené patelární reflexy, ztráta vědomé propriorecepce), exoftalmem, podvýživou, neschopností vstát. V některých chovech dojných krav je až 87 % zvířat séropozitivních na NC a studie vyšetřující velký počet zmetaných plodů ukazují, že 12 – 42 % abortovaných plodů dojnic je pozitivních na NC. Naopak velice kusé jsou informace o zmetcích krav chovaných na maso [10].

Ke stanovení definitivní diagnózy abortu v důsledku infekce plodu NC je nutný průkaz parazita ve zmetaném plodu, za pomocí histologických, či PCR metod. Ačkoli bradyzoity je možné najít v různých tkáních, mozek a plod jsou tím nejvhodnějším materiálem. Vyšetření séra zmetající krávy je pouze indikátorem.

Hammondia heydorni (HH) patří do skupiny kokcidií s řadou mezihostitelů (přežvýkavci) a definitivními hostiteli jsou psovité šelmy. U mezihostitelů i definitivních hostitelů nejsou popsány žádné klinické příznaky [9]. U diagnostiky HH jsou využívány spíše metody molekulární biologie (PCR). Ze sérologických metod lze použít ELISA nebo aglutinační testy. Na základě životního cyklu či morfologie je velice těžké oba tyto parazitární původce rozpoznat.

 

Bovinní besnoitioza, parazitární onemocnění způsobené parazitem Besnoitia besnoiti, se vyskytuje hlavně u masného skotu a je považována za znovuobjevenou infekci skotu v západní Evropě. K horizontálnímu přenosu pravděpodobně dochází buď pomocí členovců sajících krev, nebo díky přímému kontaktu mezi infikovaným a neinfikovaným skotem. Onemocnění je chronické, vysilující a charakterizované vývojem cyst v podkožní tkáni. Je zajímavé, že konečný hostitel není znám a tím pádem i celý životní cyklus zbývá objasnit [11]. Studium Besnoitia sp. pomocí molekulárně biologických metod je výzvou, protože genom stále není sekvenován, v databázích je k dispozici pouze 61 nukleotidových sekvencí [12].

 

 

Parazitární původci mohou být příčinou poruch zdravotního stavu zvířat. Kromě klinického průběhu onemocnění jsou také zjišťovány i tzv. latentní (skryté) parazitární infekce. Ty probíhají bez výrazných klinických příznaků a mohou zhoršovat či dokonce urychlovat procesy vývoje jiného onemocnění. Snižují odolnost proti jiným infekčním agens, zhoršují využitelnost krmiva a následně ovlivňují celkovou užitkovost zvířete. Především u mladých jedinců se zpožďuje normální fyziologický růst a vývoj, což může zanechat trvalé následky po celý další život zvířete, případně může tento stav skončit i úhynem daného jedince. K zamezení úmrtí jedinců ve stádech je důležitý včasný zásah zabraňující rozšíření parazitárních agens v chovu a přesná diagnostika parazitárních původců.

Úspěšná diagnostika protozoárních parazitů závisí na několika faktorech. Patří k nim správné odebrání vzorku, správná manipulace s odebraným vzorkem při transportu do laboratoře, správně zvolená detekční metoda v laboratoři a správná interpretace získaných výsledků. Pro detekci parazitů či jejich vývojových stádií lze použít vzorky trusu, krve, sputa. Při výběru vhodné diagnostické metody a interpretaci získaných výsledků je nutné vzít v potaz věk zvířete, roční období, historii výskytu parazitů v chovu či předchozí použití anthelmintických preparátů.

Vzorky trusu je vhodné zpracovávat co nejčerstvější. Při transportu do laboratoře se posílají ideálně chlazené na 4°C, případně při dlouhé době transportu na ledu nebo s chladítky. Alternativou pro transport či případnému skladování vzorku může být přídavek 10% formalinu (jeden díl trusu a devět dílů formalinu).

Vzorky krve odebrané v HEMOS zkumavkách se nesmí nikdy zamrazit, lze je transportovat do laboratoře při pokojové teplotě (do 22 °C) maximálně do 24 h nebo při chladničkové teplotě (do 8 °C) je možné vzorky plné krve skladovat po maximální dobu 3 dní. Vždy je však nejlepší vzorky transportovat co nejdříve do laboratoře bez přerušení chladícího řetězce.

 

Diagnostické metody vzorků vhodných pro parazitologické vyšetření jsou pro přehlednost rozděleny do čtyř kapitol: 1) Koncentrační metody 2) Mikroskopie a barvení 3) Sérologické metody 4) Molekulární metody.

 

1) Koncentrační metody

 

Tyto metody se používají ke zvýšení výtěžku oocyst ze vzorku (trus, tkáň). Jedná se o metody flotace a sedimentace a larvoskopie. Zatímco sedimentace se využívá hlavně pro detekci vajíček motolic, larvoskopie pro záchyt plicnivek, flotace je nejčastěji používaná koprologická metoda. Pomocí této se provádí celkové parazitologické vyšetření trusu na parazitózy nejen protozoárního původu. Principem flotační metody je zakoncentrování parazitů a jejich vývojových stádií (oocyst, cyst, vajíček) ve flotačním roztoku ze vzorku trusu. Roztok o definované specifické hustotě může být připraven z cukru, chloridu sodného, síranu hořečnatého, síranu zinečnatého či dusičnanu sodného, dle druhu sledovaného agens. Použití cukerných roztoků je výhodnější, neboť nedochází tak často k plazmolýze a deformaci vajíček/oocyst, což je důležité při následné mikroskopii, neboť morfologie (velikost a tvar) je jedním z rozpoznávacích kritérií. Nevýhodou cukerných roztoků je to, že cukr může být znečištěný a lepkavý a také přitahuje mouchy a jiné členovce. Pokud při flotaci není zvolena správná specifická hustota, dochází k poklesu účinnosti celé metody. Při příliš nízké specifické hustotě dochází k menší separaci vývojových stádií parazitů od debritu a naopak při vysoké specifické hustotě může docházet k vyplavání debritu, plazmolýze nebo až k popraskání vývojových stádií parazitů.

 

2, Mikroskopie a specifické barvení

 

Mezi standartní vyšetřovací metody parazitů patří mikroskopické vyšetření, které slouží pro vyšetřování vzorků trusu, krve, nativních preparátů i histologických preparátů. Mikroskopie je náročná na práci a vyžaduje zkušeného operátora. Tato metoda následuje po metodách koncentračních, protože tyto metody samy o sobě nejsou schopné parazitárního původce vizualizovat. Dle druhu sledovaného parazita se používají různě upravené koncentrační roztoky a postupy barvení preparátů. Pro detekci Giardií, Kryptopsoridií, Toxoplasmózy a Neosporózy v trusu je vhodné použít tzv. Sheatherův roztok (C₁₂H₂₂O_11; sacharóza 1,15 g/cm³) a dále doplnit o přidání kapky Lugolova činidla pro detekci Giardií, obarvit preparát karbolfuchsinem či dle Ziehl-Nielsena/dle Miláčka a Vítovce nebo s využitím fluorescenčního mikroskopu a monoklonálních protilátek pro detekci Kryptosporidií, Toxoplasmy gondii, Neospory caninum, Babesia gibsoni (IFAT). Mikroskopickým vyšetřením lze kompresní metodou detekovat Sarcocysty ve tkáni mezihostitelů, stejně jako mikroskopický nález tkáňových cyst Toxoplasmy gondii a Neospory caninum v histologických preparátech. Pro kvantitativní průkaz kokcidií slouží flotace následovaná vyšetření vzorku v McMasterově komůrce (následným přepočtem získáme počet oocyst/cyst/larev na gram trusu).

 

Pro fluorescenční barvení u protozoárních parazitů lze použít Auramin-rhodamin, auramin-fenol, auramin-karbol fuchsin a akridinovou oranžovou. Jeho hlavní výhodou je rychlý screening a vyšší účinnost detekce než klasická mikroskopie a ELISA. Omezením metody je nízká citlivost, nízká specificita a vysoké náklady.  Imunofluorescenční barvení - citlivost detekce některých protozoárních parazitů (např. Kryptosporidium nebo Giardia) lze zvýšit pomocí barvení preparátů se specifickými fluorescenčně značenými protilátkami. Použití této metody je striktně vázáno na existenci specifických protilátek a nutností laboratorního vybavení - fluorescenční mikroskop.

 

3) Sérologické metody

 

Sérologické vyšetření je převážně založené na vyšetření sér, vzorky trusu však lze také vyšetřit pomocí sérologických metod. Rozlišujeme metody detekující protilátky a metody detekující antigen.

Antigenní sérologické metody využívají specifických protilátek produkovaných proti konkrétním protozoárním parazitům. Tyto protilátky umožňují zachycení daného patogena například ve formátu ELISA metody (mikrotitrační destička) nebo imunochromatografie (rapid testy; membrána ve formě stripu). Obě uvedené metody jsou časově i finančně nenáročné. V obou případech se i pro zlevnění a urychlení dá zkombinovat více patogenů, které by mohli být za daný průběh nemoci zodpovědní. Ukázkou by mohla být například diagnostika průjmových onemocnění skotu. Průjem je hlavní příčinou úmrtnosti telat do jednoho měsíce věku. Jedná se o multifaktoriální onemocnění, které může být způsobeno viry (koronaviry, rotaviry), bakteriemi: (Salmonella, patogenní kmeny Eschericha coli), protozoarními parazity (Cryptosporidium parvum, Giardia intestinalis, kokocidie) anebo kombinací všech vyjmenovaných dohromady. Sloučením detekce specifických protilátek proti uvedeným patogenům lze v rámci odběru jednoho vzorku, v jednom kroku, v jedné zkumavce vyšetřit výskyt/absenci těchto patogenů. Na trhu existují komerční diagnostické soupravy ve formě několikakrokové, maximálně desítky minut trvající in situ analýzy, skládající se z kombinací infekčních agens způsobujících průjmy (například FASTest® CRYPTO-GIARDIA Strip, RIDAQuick, Remel-Xpect nebo RAINBOW LAMB & KID - BIO K 316).

Metody detekující protilátky jsou v diagnostice využívány také. Pokud je k dispozici (komerčně) specifický antigen, je tento navázán na dno mikrotitirační destičky, kde v případě přítomnosti protilátek v analyzovaném séru, dochází k vytvoření komplexu, který je po vizualizaci detekován pomocí spektrofotometru. Pro řadu patogenů jsou takovéto testy (ELISA) již běžně k dostání ve formě plně validovaných souprav. Novým přístupem je využití přístroje, který dokáže spojit několik diagnostických souprav do jedné reakce. Jedná se o xMAP technologii, která je založena na kombinaci existujících laboratorních metod jako jsou PCR, průtoková cytometrie a ELISA. Tato technologie umožňuje detekci a kvantifikaci více než 100 různých analytů (nukleových kyselin nebo proteinů) současně v průběhu jedné reakce za použití značených mikrokuliček [13, 14].

 

 

4) Molekulární metody

 

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je nejcitlivější ze všech metod detekce v klinických i environmentálních vzorcích. Lze ji použít nejen pro identifikaci, ale i při genotypizaci a subtypizaci protozoárních agens. Oproti metodám uvedeným dříve se však molekulární metody potýkají s několika problémy: PCR metody nejsou standardizovány, laboratoře používají tzv. home-made systémy, nejsou jasně definovány specifické detekční/genotypizační cíle, či jsou používány složité protokoly pro izolaci DNA [15].

Konvenční PCR využívající dvě sady primerů, tzv. nested PCR, konvenční PCR v kombinaci s enzymatickým štěpením PCR produktů nebo polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) jsou varianty, které se běžně užívaly k identifikaci a genotypizaci jednotlivých protozoárních parazitů.

Pomocí fluorescenčně značených sond lze sledovat množení PCR produktů v reálném čase při real time PCR. Tato varianta metody PCR umožňuje vyšší citlivost, reprodukovatelnost a specifitu. Účinnost této metody je značně závislá na zvoleném způsobu izolace DNA a také na vhodně zvolené a validované PCR metodě. Tedy na specifických genech pro dané parazitární patogeny. V odborných publikacích lze takového geny najít (Tabulka 1). 

 

V posledních několika letech nejnověji vznikající technologie pro molekulární metody (LUMINEX, FimArray) využívají multiplexního přístupu k diagnostice. Výhody testování jednoho vzorku na více potenciálně možných patogenů, mající podobné klinické příznaky pomocí jediného testu jsou v: zkrácení doby testování, možnosti identifikovat koinfekci a v neposlední řadě i značná finanční úspora [16, 17]. Výsledkem nejnovější studie jsou literaturou doložitelné informace, že tyto metody správně identifikují jednotlivé patogeny, avšak je třeba tyto metody dobře validovat [16].

 

Izotermická amplifikace LAMP je obdoba metody PCR. Avšak oproti PCR je při tomto množení cílových sekvencí použita jen jedna konstantní teplota. Produkt amplifikace může být vizuálně detekován pouhým okem podle zákalu vytvořeného v důsledku pyrofosforečnanu hořečnatého vytvořeného jako vedlejší produkt během reakce nebo pomocí fluorescenčních barviv. Výhodou je jednoduchý postup, nízké náklady, protože nevyžaduje nákladné vybavení, jako jsou termocyklery. [18].

 

Součástí diagnostiky protozoárních parazitů je také testování životaschopnosti. Kromě klasických metod (kultivace, biologický pokus) existují v současné době metody molekulární biologie, které mohou metodu kultivace zastoupit či dokonce nahradit. Jedná se například o použití barviv, které mohou selektivně pronikat do buněk. Tato barviva mohou být nefluorescenční (například trypanová modř), emitující flourescenci po štěpení (například fluorescein diacetát, FDA nebo ROX) nebo flourescenční (například propidium monoazid, PMA, propidium jodid, PI nebo ethidiumbromid, EB, SYTO-9). Principem jejich použití je inkubace vzorku nebo koncentrovaného protozoárního původce s jedním z typů barviv. Ta, dle typu použitého barviva, difundují do živých/mrtvých buněk a následuje vizualizace. K vizualizaci může být použito mikroskopie nebo může být barvivo použito v kombinaci s PCR [19].

Další metodou k prokázání životaschopnosti je amplifikace založená na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA) je izotermická a citlivá technika pro množení specifických mRNA, které byly popsány pro mnoho mikroorganismů [20]. Použití této metod dosud proběhlo jen na uměle kontaminovaných vzorcích. Experimentálně bylo zjištěno, že mRNA se vyskytuje jak v živých tak i mrtvých buňkách a vhodnost této metody je tedy diskutabilní [21].

Další typ RNA – rRNA je považován za ideální cíl pro testování životaschopnosti (vysoká citlivost, krátký poločas rozpadu či přítomnost ve vysokém počtu kopií v životaschopných buňkách). Metoda fluorescence in situ hybridizace (FISH) spočívá v zacílení na sekvenci nukleové kyseliny pomocí specifické syntetické fluorescenční oligonukleotidové sondy [4].

Všechny testy životaschopnosti logicky uzavírají metody detekce protozoárních parazitů a jsou založeny na vyhodnocení odlišnosti fyziologických parametrů, které se mohou lišit v závislosti na aplikovaném ošetření, u příslušných prvoků a jejich původním fyziologickém stavu.

 

V Tabulce 2. jsou shrnuty laboratoře v rámci celé České republiky nabízející komerční diagnostiku protozoárních parazitů z několika matric. Jednotlivé typy odebraných vzorků a jejich odeslání do laboratoře  je vždy lepší vybranou laboratoří konzultovat. 

 

 

 

 

Tabulka 1. Příklad specifických genů a navržených primerů, které se používají v diagnostice protozoárních parazitů.

 

Patogen	Gen	Sekvence primeru	Velikost amplikonu (bp)	Reference
Toxoplasma gondii	B1 gene	B22: 5′-AACGGGCGAGTAGCACCTGAGGAGA-3′ B23: 5′-TGGGTCTACGTCGATGGCATGACAAC-3′	115	[22]
	529 bp	TOX4: 5´-CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG-3´ TOX5: 5´-CGCTGCAGACAGAGTGCATCTGGATT-3´	529	[22]
	RH repeat region	5′-AGAGACACCGGAATGCGATCT-3′ 5′-CCCTCTTCTCCACTCTTCAATTCT-3′ Cy3: 5´-ACGCTTTCCTCGTGGTGATGGCG-3´	N/A	[23]
	18S rRNA	Ext18S: 5´-CGGGTAACGGGGAATTAGGG-3' Ext18S: 5'-TCAGCCTTGCGACCATACTC-3´ int18S: 5'-GGTGTGCACTTGGTGAATTCTA-3' int18S: 5'-TGCAGGAGAAGTCAAGCATGA-3'	571 405	[24]
	SporoSAG	5′-CGGACAAATGTGGCGTACAC-3′ 5′-GTG ATCTTGCGCCGAACAC-3′ 5´-FAM-TTCTCGTCAAAGCGGCACCACAGG-3′ BHQ	71	[25]
Hammondia heydorni	ITS1	JS4: 5′-CGAAATGGGAAGTTTTGTGAAC-3′ JS5: 5′- AGCAGCTACATACGTAGA-3′	267	[26]
Neospora caninum	ITS	NS3: 5-GTGGATATTTTGCACTA-3 SR1	149	[26]
	Nc5	Np6+/Np21+	337	[27]
Giardia intestinalis	Β-giardin	BGF 5´- GCCCTCAAGAGCCTGAACG-3′ BGR 5´- GCGATCGTCTCCTTCTCGAT-3′ BGP- 5´- FAM-GACCAGCTCAACGAGAA-BHQ-3’	140	[28]
	gdh	GDHeF 5´-TCAACGTYAAYCGYGGYTTCCGT-3′ GDH2 5´-ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA-3′ GDHiF 5´- CAGTACAACTCYGCTCTCGG -3′ GDH4 5´- GTGGCGCARGGCATGATGCA-3′	781 743	[29, 30]
Cryptosporidium parvum	Hsp70	hsp70F: 5´- CAAGCTGCTATCTTAAATGG - 3´ hsp70R: 5´- GAGCAACATCCAATAATAAGAG - 3´	140	[31]
Tritrichomonas foetus	5.8S rRNA	Tfoe_F 5´- GCGGCTGGATTAGCTTTCTTT - 3´ Tfoe_R 5´- GGCGCGCAATGTGCAT - 3´ Tfoe_pb 5´- FAM-ACAAGTTCGATCTTTG-MGB- 3´	58	[32]
Babesia spp.	18S rRNA	BabsppF1: 5´- GTTTCTGMCCCATCAGCTTGAC - 3´ BabsppR: 5´- CAAGACAAAAGTCTGCTTGAAAC- 3´	422-440	[33]
Sarcocystis spp.	18S rRNA	Sarc 18S Fex: 5´- GGTGATTCATAGTAACCGAACG- 3´ Sarc 18S Rex: 5´- GATTTCTCATAAGGTGCAGGAG- 3´	900	[34]

 

 

 

Tabulka 2. Seznam laboratoří z České republiky i zahraničí provádějící dostupnou aktuální diagnostiku protozoárních parazitů.

 

 

Patogen	Diagnostická metoda	Matrice	Hostitel	Místo zpracování
Kokcidie	flotace + McMasterova komůrka (OPG)	trus	skot, ovce, kozy	SVÚ Jihlava, SVÚ Praha - SVÚ Hradec Králové, VFU Brno
Kryptosporidie	flotace + mikroskopie  Specifické barvicí metody karbolfuchsinem nebo dle Miláčka a Ziehl-Neelsena, imunochromatografický preparát.	trus	skot, ovce, kozy	SVÚ Jihlava, VFU Brno
	IFAT, ELISA	trus	skot, ovce, kozy	Laboklin, Idexx
	PCR	trus	skot, ovce, kozy	Laboklin
	imunochromatografický test RapidTest, FAST test, FAST Test Crypto-Giardia	trus	skot, ovce, kozy	Rainbow, Bovine Enterichek, LABtechnik
Giardia intestinalis	flotace (CPG) + Lugolův roztok	trus	skot, ovce, kozy, vysoká	SVÚ Jihlava, VFU Brno
	ELISA	trus		IDEXX
	FASTest Giardia - imunochromatografický test	trus	skot, ovce, kozy, vysoká	SVÚ Olomouc, SVÚ Jihlava
Tritrichomonas foetus	Mikroskopie nativního preparátu, kultivace z výplašku – průkaz patogena.	výplašky a seškraby z prepuc. vaku, vaginy/dělohy	skot	SVÚ Jihlava, SVÚ Praha -SVÚ Hradec Králové
	PCR	Stěry, výplachy, placenta, zmetek	skot	SVÚ Jihlava, Laboklin
Neospora caninum	ELISA, nepřímý imunofluorescenční test (IFAT) – průkaz protilátek přímý imunofluorescenční test (DIF) – průkaz antigenu parazita	sérum, krev, orgány, nekrotická tkán	skot	SVÚ Jihlava, SVÚ Olomouc, SVÚ Praha
	RT-PCR – nukleová kyselina původce	orgány, výtěry, zmetek	skot	SVÚ Praha, SVÚ Jihlava, Laboklin
Toxoplasma gondii	Latex test, ELISA, IFAT (IgG titr protilátek), IFAT (IgM titr protilátek),	sérum, tkáň	skot, ovce, kozy	SVÚ Jihlava, SVÚ Praha, SVÚ Olomouc
	flotace	trus		SVÚ Jihlava, VFU Brno
	PCR	orgány, výtěry, trus, zmetek		SVÚ Jihlava, SVÚ Praha , Laboklin
Babesia spp.	Krevní roztěr – mikroskopie, barvení dle Giemsy	plná krev	skot	SVÚ Jihlava, Laboklin, VFU Brno
	PCR	EDTA, krev	skot	Laboklin
	RT-PCR	klíště	skot	Laboklin
	ELISA	sérum	skot	Laboklin
Babesia gibbsoni	IFAT PCR, sekvenování	krev	skot	SVÚ Praha
Babesia bovis	ELISA	sérum	skot	SVÚ Olomouc
Sarcocystis spp.	nativni preparát - kompresní metoda ze svaloviny PCR	skot	svalovina, orgány	SVÚ Jihlava, VFU Brno

 

 

Použitá literatura:

 

1. Wenzel, J.C., et al., Trichomoniasis in Beef Cattle. 2015: NM State University, Cooperative Extension Service, College of Agricultural, Consumer and Environmental Sciences.
2. Mukhufhi, N., et al., Evaluation of a PCR test for the diagnosis of Tritrichomonas foetus infection in bulls: effects of sample collection method, storage and transport medium on the test. Theriogenology, 2003. 60(7): p. 1269-78.
3. KHODAKARAM-TAFTI, A. and M. HASHEMNIA, An overview of intestinal coccidiosis in sheep and goats. Revue Méd. Vét, 2017. 167(1-2): p. 9-20.
4. Rousseau, A., et al., Assessing viability and infectivity of foodborne and waterborne stages (cysts/oocysts) of Giardia duodenalis, Cryptosporidium spp., and Toxoplasma gondii: a review of methods. Parasite, 2018. 25: p. 14.
5. Bartova, E., K. Sedlak, and M. Budikova, A study of Neospora caninum and Toxoplasma gondii antibody seroprevalence in healthy cattle in the Czech Republic. Ann Agric Environ Med, 2015. 22(1): p. 32-4.
6. Liu, Q., et al., Diagnosis of toxoplasmosis and typing of Toxoplasma gondii. Parasit Vectors, 2015. 8: p. 292.
7. Dubey, J.P., et al., Public health and economic importance of Toxoplasma gondii infections in goats: The last decade. Res Vet Sci, 2020. 132: p. 292-307.
8. Braunig, P., et al., DNA extraction methods and multiple sampling to improve molecular diagnosis of Sarcocystis spp. in cattle hearts. Parasitol Res, 2016. 115(10): p. 3913-21.
9. Sinnott, D., et al., Detection of Hammondia heydorni DNA in feces collected in and around an Ohio Wildlife Conservation Center. Vet Parasitol Reg Stud Reports, 2016. 6: p. 31-34.
10. Lindsay, D.S. and J.P. Dubey, Neosporosis, Toxoplasmosis, and Sarcocystosis in Ruminants: An Update. Vet Clin North Am Food Anim Pract, 2020. 36(1): p. 205-222.
11. Alvarez-Garcia, G., et al., Dynamics of Besnoitia besnoiti infection in cattle. Parasitology, 2014. 141(11): p. 1419-35.
12. Gutierrez-Exposito, D., et al., The role of wild ruminants as reservoirs of Besnoitia besnoiti infection in cattle. Vet Parasitol, 2016. 223: p. 7-13.
13. Reslova, N., et al., A novel perspective on MOL-PCR optimization and MAGPIX analysis of in-house multiplex foodborne pathogens detection assay. Sci Rep, 2019. 9(1): p. 2719.
14. Reslova, N., et al., xMAP Technology: Applications in Detection of Pathogens. Front Microbiol, 2017. 8: p. 55.
15. Laude, A., et al., Is real-time PCR-based diagnosis similar in performance to routine parasitological examination for the identification of Giardia intestinalis, Cryptosporidium parvum/Cryptosporidium hominis and Entamoeba histolytica from stool samples? Evaluation of a new commercial multiplex PCR assay and literature review. Clin Microbiol Infect, 2016. 22(2): p. 190 e1-190 e8.
16. Freeman, K., et al., Multiplex tests to identify gastrointestinal bacteria, viruses and parasites in people with suspected infectious gastroenteritis: a systematic review and economic analysis. Health Technol Assess, 2017. 21(23): p. 1-188.
17. Zhang, H., S. Morrison, and Y.W. Tang, Multiplex polymerase chain reaction tests for detection of pathogens associated with gastroenteritis. Clin Lab Med, 2015. 35(2): p. 461-86.
18. Bakheit, M.A., et al., Sensitive and specific detection of Cryptosporidium species in PCR-negative samples by loop-mediated isothermal DNA amplification and confirmation of generated LAMP products by sequencing. Vet Parasitol, 2008. 158(1-2): p. 11-22.
19. Zeng, D., et al., Advances and Challenges in Viability Detection of Foodborne Pathogens. Front Microbiol, 2016. 7: p. 1833.
20. Honsvall, B.K. and L.J. Robertson, Real-time nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) assay targeting MIC1 for detection of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis oocysts. Exp Parasitol, 2017. 172: p. 61-67.
21. Honsvall, B.K. and L.J. Robertson, From research lab to standard environmental analysis tool: Will NASBA make the leap? Water Res, 2017. 109: p. 389-397.
22. de Souza, C.Z., et al., An alternative method to recover Toxoplasma gondii from greenery and fruits. Int J Environ Health Res, 2016. 26(5-6): p. 600-5.
23. Hohweyer, J., et al., Simultaneous detection of the protozoan parasites Toxoplasma, Cryptosporidium and Giardia in food matrices and their persistence on basil leaves. Food Microbiol, 2016. 57: p. 36-44.
24. Shapiro, K., et al., Simultaneous detection of four protozoan parasites on leafy greens using a novel multiplex PCR assay. Food Microbiology, 2019. 84: p. 10.
25. Travaille, E., et al., Development of a qRT-PCR method to assess the viability of Giardia intestinalis cysts, Cryptosporidium spp. and Toxoplasma gondii oocysts. Food Control, 2016. 59: p. 359-365.
26. Slapeta, J.R., et al., Coprodiagnosis of Hammondia heydorni in dogs by PCR based amplification of ITS 1 rRNA: differentiation from morphologically indistinguishable oocysts of Neospora caninum. Vet J, 2002. 163(2): p. 147-54.
27. Spencer, J.A., A.K. Witherow, and B.L. Blagburn, A random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction technique that differentiates between Neospora species. J Parasitol, 2000. 86(6): p. 1366-8.
28. Hijjawi, N., et al., Comparison of ELISA, nested PCR and sequencing and a novel qPCR for detection of Giardia isolates from Jordan. Exp Parasitol, 2018. 185: p. 23-28.
29. Caccio, S.M., et al., Multilocus genotyping of Giardia duodenalis reveals striking differences between assemblages A and B. Int J Parasitol, 2008. 38(13): p. 1523-31.
30. Read, C.M., P.T. Monis, and R.C. Thompson, Discrimination of all genotypes of Giardia duodenalis at the glutamate dehydrogenase locus using PCR-RFLP. Infect Genet Evol, 2004. 4(2): p. 125-30.
31. Cohn, B., et al., Putative cis-regulatory elements associated with heat shock genes activated during excystation of Cryptosporidium parvum. PLoS One, 2010. 5(3): p. e9512.
32. McMillen, L. and A.E. Lew, Improved detection of Tritrichomonas foetus in bovine diagnostic specimens using a novel probe-based real time PCR assay. Vet Parasitol, 2006. 141(3-4): p. 204-15.
33. Lempereur, L., et al., Guidelines for the Detection of Babesia and Theileria Parasites. Vector Borne Zoonotic Dis, 2017. 17(1): p. 51-65.
34. Hoeve-Bakker, B.J.A., J.W.B. van der Giessen, and F.F.J. Franssen, Molecular identification targeting cox1 and 18S genes confirms the high prevalence of Sarcocystis spp. in cattle in the Netherlands. Int J Parasitol, 2019. 49(11): p. 859-866.